Жидкие биопсии для диагностики рака

Как правило, опухоли исследуются с использованием биопсии тканей. Небольшой образец берется из опухоли и генотипируется, или анализируется на генетический состав. Проблема этого подхода заключается в том, что биопсия опухолей может быть сложной задачей. Кроме того, биопсия опухоли дает только снимок опухоли.

Запись в Discovery Medicine в 2015 году Labgaa и соавторы заявляют о традиционной биопсии опухоли:

«По очевидным причинам трудно контролировать развитие опухоли с помощью последовательных биопсий. Кроме того, биопсия отражает только одно пятно опухоли и, следовательно, вряд ли будет представлять весь спектр соматических мутаций в больших опухолях. Альтернативой может быть получение нескольких биопсия той же опухоли, но этот вариант не кажется ни реалистичным, ни точным ».

Жидкая биопсия включает измерение циркулирующей ДНК (ктДНК) и других побочных продуктов опухоли в образцах крови, полученных от больных раком. Этот новый диагностический подход обещает быть быстрым, неинвазивным и экономически эффективным.

История жидкой биопсии

В 1948 году пара французских исследователей Мандель и Метай впервые определили ктДНК в крови здоровых людей. Это открытие опередило свое время, и только спустя десятилетия ктДНК была дополнительно исследована.

В 1977 году Леон и его коллеги впервые обнаружили повышенное количество ктДНК в крови больных раком. К 1989 году Stroun и коллеги идентифицировали неопластические (то есть, раковые) характеристики в крови. После этих открытий несколько других групп идентифицировали специфические мутации в опухолевых супрессорах и онкогенах, нестабильность микросателлитов и метилирование ДНК, которые доказали, что ктДНК высвобождается в циркуляцию опухолями.

Хотя мы знаем, что ктДНК, полученная из опухолевых клеток, циркулирует в крови, происхождение, скорость высвобождения и механизм высвобождения этой ДНК неясны, а исследования дают противоречивые результаты. Некоторые исследования показывают, что более злокачественные опухоли содержат больше мертвых раковых клеток и выделяют больше ктДНК. Тем не менее, некоторые исследования показывают, что все клетки выделяют ктДНК. Тем не менее, представляется вероятным, что раковые опухоли высвобождают повышенные уровни ктДНК в кровь, что делает ктДНК хорошим биомаркером рака.

Из-за сильной фрагментации и низких концентраций в крови ктДНК трудно выделить и проанализировать. Существует несоответствие концентраций ктДНК между образцами сыворотки и плазмы.Кажется, что сыворотка крови, а не плазма крови, является лучшим источником ктДНК. В исследовании, проведенном Umetani и его коллегами, было обнаружено, что концентрации ктДНК в плазме крови постоянно ниже по сравнению с сывороткой из-за возможной потери циркулирующей ДНК во время очистки, поскольку коагуляция и другие белки удаляются во время приготовления образца.

По словам Хайтцера и его коллег, вот некоторые конкретные проблемы, которые необходимо решить, чтобы использовать диагностический потенциал ктДНК:

«Во-первых, преаналитические процедуры должны быть стандартизированы…. Выбор метода выделения, который обеспечивает выделение достаточного количества высококачественной ДНК, имеет решающее значение, и было показано, что преаналитические факторы отбора и обработки крови могут сильно влиять на выход ДНК…. Во-вторых, одним из наиболее важных вопросов является отсутствие гармонизации методов количественной оценки. Различные методы количественной оценки … дают разные результаты, потому что эти измерения нацелены либо на общую, либо только на амплифицируемую ДНК … В-третьих, о происхождении и подробности известно меньше механизм высвобождения ктДНК, и в большинстве исследований смешанные события, которые могут также способствовать высвобождению ктДНК ".

Целевые и нецелевые подходы

В настоящее время существует два основных подхода к анализу плазмы крови (или сыворотки) на предмет ктДНК. Первый подход нацелен и ищет специфические генетические изменения, характерные для опухолей. Второй подход не предназначен и включает анализ всего генома в поисках ктДНК, отражающей рак. Альтернативно, секвенирование exome использовалось как более рентабельный, нецелевой подход. Exomes - это части ДНК, которые транскрибируются для получения белка.

При целенаправленных подходах сыворотка анализируется на наличие известных генетических мутаций в небольшом наборе мутаций драйвера. Мутации водителя относятся к мутациям в геноме, которые стимулируют или «стимулируют» рост раковых клеток. Эти мутации включают KRAS или же EGFR.

Из-за технологических достижений последних лет стали возможными целевые подходы к анализу генома для небольших количеств ктДНК. Эти технологии включают ARMS (амплификационная система рефрактерной мутации); цифровая ПЦР (dPCR); шарики, эмульсии, амплификации и магнетики (BEAMing); и глубокое секвенирование (CAPP-Seq).

Несмотря на то, что были достигнуты технологические успехи, делающие возможным целевой подход, целевой подход нацелен только на несколько позиций мутаций (горячих точек) и пропускает множество мутаций-драйверов, таких как гены-супрессоры опухолей.

Основное преимущество нецеленаправленных подходов к жидкой биопсии заключается в том, что они могут быть использованы у всех пациентов в связи с тем, что тест не основан на повторяющихся генетических изменениях. Периодические генетические изменения не охватывают все виды рака и не являются специфическими признаками рака. Тем не менее, этому подходу не хватает аналитической чувствительности, и всесторонний анализ опухолевых геномов пока невозможен.

Следует отметить, что цена секвенирования всего генома существенно снизилась. В 2006 году цена секвенирования всего генома составляла приблизительно 300 000 долларов США. К 2017 году стоимость снизилась примерно до 1000 долларов США за геном, включая реагенты и амортизацию секвенаторов.

Клиническая полезность жидкой биопсии

Первоначальные попытки использовать ктДНК были диагностическими и сравнивали уровни у здоровых пациентов с таковыми у больных раком или с доброкачественными заболеваниями. Результаты этих усилий были неоднозначными, и только в некоторых исследованиях были выявлены значительные различия, указывающие на рак, отсутствие заболеваний или рецидив.

Причина, по которой ктДНК может использоваться только для диагностики рака, заключается в том, что переменные количества ктДНК происходят из опухолей. Не все опухоли «проливают» ДНК в одинаковом количестве. В целом, более распространенные, широко распространенные опухоли выделяют в кровоток больше ДНК, чем ранние локализованные опухоли. Кроме того, различные типы опухолей выбрасывают различные количества ДНК в кровоток. Фракция циркулирующей ДНК, полученная из опухоли, широко варьируется между исследованиями и типами рака, варьируя от 0,01% до 93%. Важно отметить, что, как правило, только небольшая часть ктДНК происходит из опухоли, а остальная часть - из нормальных тканей.

Циркулирующая ДНК может быть использована в качестве прогностического маркера заболевания. Циркулирующая ДНК может быть использована для мониторинга изменений рака с течением времени. Например, одно исследование показало, что двухлетняя выживаемость у пациентов с колоректальным раком (то есть число пациентов, еще живых по крайней мере через два года после постановки диагноза с колоректальным раком) и KRAS мутации горячих точек были на 100 процентов у тех, у которых нет признаков соответствующей циркулирующей ДНК. Более того, возможно, что в ближайшем будущем циркулирующая ДНК может быть использована для мониторинга предраковых поражений.

Циркулирующая ДНК также может быть использована для мониторинга реакции на терапию. Поскольку циркулирующая ДНК обеспечивает лучшую общую картину генетического состава опухолей, эта ДНК, вероятно, содержит диагностическую ДНК, которую можно использовать вместо диагностической ДНК, получаемой из самих опухолей.

Теперь давайте взглянем на некоторые конкретные примеры жидкой биопсии.

Guardant360

Guardant Health разработал тест, который использует секвенирование следующего поколения для профилирования циркулирующей ДНК для мутаций и хромосомных перестроек для 73 генов, связанных с раком. Guardant Health опубликовал исследование, в котором сообщается об использовании жидкой биопсии в онкологии. В исследовании использовались образцы крови от 15 000 пациентов с комбинированными 50 типами опухолей.

По большей части результаты теста с жидкой биопсией соответствуют изменениям гена, наблюдаемым при биопсии опухоли.

Согласно NIH:

«Guardant360 идентифицировал те же самые критические мутации в важных генах, связанных с раком, таких как EGFR, BRAF, KRAS, а также PIK3CA на частотах, очень похожих на то, что было ранее идентифицировано в образцах биопсии опухоли, статистически коррелируя с 94% до 99% ».

Кроме того, согласно NIH, исследователи сообщили следующее:

«Во втором компоненте исследования исследователи оценили почти 400 пациентов, большинство из которых имели рак легких или колоректальный рак, у которых были доступны как ктДНК крови, так и ДНК ДНК опухолевой ткани, и сравнили паттерны геномных изменений. Общая точность жидкости биопсия по сравнению с результатами анализов биопсии опухоли составила 87%. Точность возросла до 98%, когда образцы крови и опухоли были собраны в течение 6 месяцев друг от друга ».

Guardant360 был точным, хотя уровень циркулирующей ДНК в крови был низким. Часто циркулирующая опухолевая ДНК составляла только 0,4 процента ДНК в крови.

В целом, используя жидкую биопсию, исследователи Guardant смогли идентифицировать опухолевые маркеры, которые могли бы направлять лечение у врачей у 67 процентов пациентов. Эти пациенты имели право на одобренное FDA лечение, а также на исследовательскую терапию.

ктДНК и рак легких

В 2016 году FDA одобрило мутационный тест cobas EGFR, который будет использоваться для обнаружения EGFR мутации в циркулирующей ДНК больных раком легких. Этот тест был первой FDA-одобренной жидкой биопсией и идентифицировал пациентов, которые могут быть кандидатами для лечения с помощью таргетной терапии с использованием эрлотиниба (Тарцева), афатиниба (Гилотриф) и гефитиниба (Иресса) в качестве лечения первой линии, и осимеритиниба (Тагриссо) в качестве лечение второй линии. Эти целевые методы лечения атакуют раковые клетки специфическим EGFR мутации.

Важно, что из-за большого количества ложноотрицательных результатов FDA рекомендует также брать образец биопсии ткани у пациента с отрицательной жидкой биопсией.

ктДНК и рак печени

Число людей, умирающих от рака печени, увеличилось за последние 20 лет. В настоящее время рак печени является второй по значимости причиной смерти от рака в мире. Нет хороших биомаркеров для обнаружения и анализа печени или гепатоцеллюлярного (ГЦК) рака. Циркулирующая ДНК может быть хорошим биомаркером рака печени.

Рассмотрим следующую цитату из Lagbaa и соавторов о возможности использования циркулирующей ДНК для диагностики рака печени:

«Гиперметилирование RASSF1A, p15 и p16 было предложено в качестве инструмента ранней диагностики в ретроспективном исследовании, включающем 50 пациентов с ГЦК. Подпись четырех аберрантно метилированных генов (APC, GSTP1, RASSF1A и SFRP1) также была проверена на диагностическую точность метилирование RASSF1A было сообщено в качестве прогностического биомаркера. В последующих исследованиях анализировали ктДНК у пациентов с ГЦК с использованием технологий глубокого секвенирования …. Поразительно, что аберрантные числа копий ДНК были обнаружены на двух носителях ВГВ без предшествующего ГЦК в анамнезе во время сбора крови, но который разработал HCC во время последующего наблюдения. Это открытие дало возможность оценить изменение количества копий в кДДНК как инструмент скрининга для раннего обнаружения HCC ».

Слово от DipHealth

Жидкие биопсии являются новым захватывающим подходом к геномной диагностике. В настоящее время некоторые жидкие биопсии, которые предлагают всестороннее молекулярное профилирование, доступны для врачей, чтобы дополнить генетическую информацию, полученную из биопсии ткани. Есть также определенные жидкие биопсии, которые могут использоваться вместо биопсии ткани - когда биопсия ткани недоступна.

Важно иметь в виду, что в настоящее время проводится много исследований с использованием жидкой биопсии, и необходимо провести дополнительные исследования, чтобы конкретизировать терапевтическую полезность этого вмешательства.